磷酸化标记核酸序列和定制序列的匹配程度，由合成仪自动生成的序列信息与质谱检测、测序检测 的结果进行比对验证。

采用6.2.2方法测定，将测得的相对分子质量与6.2.1中定制序列的理论相对分子质量（MW）进行 比对验证。

照GB/T30989执行，对磷酸化标记核酸进行序

道路标准规范范本6.4.1紫外分光光度法

按照GB/T30988执行。

按照GB/T30988执行

GB/T39512—2020

6.4.2高效液相色谱法

采用HPLC仪对磷酸化标记核酸的纯度进行测定，设备运行参数参考B.2。确保仪器状态正常后， 取10μL50μmo1/L磷酸化标记核酸溶液和20μL超纯水置于进样瓶中混匀，点击仪器运行按钮，仪器 自动进样检测。根据检测结果计算目标峰面积占所有峰面积的比值，得出磷酸化标记核酸的纯度。

采用6.2.2方法测定，计算目标峰质谱信号的强度占所有峰质谱信号强度的比值，得出磷酸化标 发的质谱纯度

采用6.2.2方法测定，计算缺碱基峰的质谱信号强度占所有峰质谱信号强度的比值，得出碱基缺 失率。

采用6.3.3方法测定，计算碱基缺失信号比例！

6.6互补链浓度差检测

6.6.1紫外吸收强度检测

6.6.1.1单链浓度检测

采用紫外分光光度法对磷酸化标记核酸进行紫外吸收强度检测，测得核酸在260nm处的吸收 OD260数值，测得的OD26a数值乘以稀释倍数作为最终定量的OD260数值，用OD260数值除以消光 换为样品浓度

6.6.1.2互补链浓度差

根据单链定量结果，计算两条互补链间的浓度差。 主：检测前离心并混匀 样 600r/min，25℃10min混匀

6.6.2质谱峰强度比检测

6.6.3化合物间浓度差检测

采用紫外分光光度法对互补链退火后形成的磷酸化标记核酸双链进行紫外吸收强度测定，将检 量浓度除以互补链混合产物的相对分子质量得出摩尔浓度，最终计算不同的磷酸化标记核酸双 摩尔浓度差即化合物间浓度差。

6.7脱磷酸化产物检测

采用6.2.2方法测定，计算 其相对分子质量比目标相对分子质量 8)的质谱信号强度占所有质谱峰 比值，得出脱磷酸率

GB/T39512—2020

的质检底物、2μL10×连接缓冲液和2.5μgT4 酶，定容至20μL后混匀制备反应液。将配

6.8.2连接效率检测

反应液进行琼脂糖凝胶电泳；电泳结果采用灰度定量法进行连接效率计算，其中连接效率三连接产 物灰度值/（连接产物灰度值十剩余原料灰度值）

贮存于一20℃冰箱，避免反复冻融。未稀释的十粉一20℃保存不宜超过1年；稀释后的 20℃不宜超过半年，

磷酸化标记核酸合成后应附合成报告单或等同的指导性文件。文件内容应至少包括以下部分： a） 名称； b） 序列； 长度； d) 纯化方式； e） 摩尔量； f) 相对分子质量； 浓度； h 保存条件和有效期。

GB/T39512—2020

电缆标准附录A （资料性附录） 磷酸化标记核酸检测指标项目及参考结果

附录A （资料性附录） 磷酸化标记核

表A.1磷酸化标记核酸检测指标及参考结果

GB/T39512—2020

表B.1流动相A、流动相B配制

梯度洗脱条件（液相色谱

民用航空标准高效液相色谱的检测条件如下：

a) 色谱柱：C1sColumn，130A，2.5μm，4.6mmX50mm b) 流动相A：0.1mo1/LTEAA；流动相B：乙睛； c) 柱温：60℃； d) 检测器：紫外检测器； e) 检测波长：260nm； f) 流速：1.0mL/min; 梯度洗脱条件参见表B.3

表B.3梯度洗脱条件（高效液相色谱法）