4.3.1.1一般原则

实验室内方法确认是通过对待确认方法与参考方法进行比较研究的方式，对得确认方法的特性参 数进行确认，从而证实该方法的适用性。 对于定性方法，至少需要确认的技术参数包括方法的相对检出水平、灵敏度、包容性和排他性。 对于定量方法至少应确认方法定量限、相对正确度、准确度、包容性和排他性、测量不确定度等技术 参数。

4.3.1.2测试样品的要求

实验室应根据方法规定预期用途，选择基质的种类和类型。测试样品应选择自然污染的样品，如果 无法获得足够数量的自然污染样品，则允许使用人为污染样品。测试样品的基质，应包含不同含量的背 景微生物（高含量，低含量）的样品，不同加工方式的样品，以及原始（未加工）的样品等。 示例1：如果待确认方法仅适用于某类基质，则只需对该类基质进行确认。如果待确认方法适用于多种基质，如食 品土壤标准，至少选择5类食品，其中每类食品选择不少于3种不同类型样品（如未加工食品、初加工食品及深加工食品等）进行 测试研究，不同类型样品各20份。 示例2；对于定性方法，理想状态是每种类型样品中有10份是阳性样本，10份是阴性样本，至少对于每一类基质，应 没置50%的阳性样本。全部阴性或阳性的样品水平是没有意义的，

RB/T033—20204.3.2实验室间方法确认4.3.2.1一般原则实验室间方法确认是通过不同实验室使用相同的样品进行检测时，比较待确认方法和参考方法特性参数，并将这些结果与待确认方法和参考方法之间可接受差异的限定标准进行比较分析。实验室间方法确认通常由8个协同实验室完成。特殊情况下，至少由5个协同实验室完成。4.3.2.2测试样品的要求由组织实验室制备统一的测试样品，并尽可能结合使用人工和自然污染样品。如没有自然污染样品，可以使用人工污染的样品。基质的选择参见4.3.1.2。对于定性方法，每一种基质至少包括3个测试水平的样本，包括阴性对照和两个测试水平的阳性样品，至少有一个水平的样品设置为获得部分阳性的结果，依据概率分布，理论上，1个菌落形成单位(CFU)/样品的测试水平应获得30%的阴性结果。每个协同实验室需要对每个水平，采用两种方法，进行8次重复试验，即每个协同实验室至少提供48个结果数据（3个水平×2个方法×8次重复）。对于定量方法，每一种基质至少包括3个测试水平，并涵盖方法的测试范围，采用两种方法，每个水平进行8次重复试验，每个样本至少2次重复，即每个协同实验室至少提供48对结果数据（96个结果）。组织实验室负责数据的统计分析，如有证据表明所获结果未严格按照检测方法或不满足检测条件要求，实验室应将该结果剔除。数据剔除后，不需要对离群值进行统计分析。注1：参与实验室间方法确认的实验室，相关的或类似的检测项目建议通过ISO17025：2017认可或具有其他等同资质。注2：用于实验室间方法确认的样本的数量及重复测试数的设计是基于检测方法与结果的准确度的考虑，详见GB/T6379.2。4.4特性参数的确认4.4.1实验室内方法研究特性参数的确认4.4.1.1灵敏度灵敏度测定的目的是确定参考方法和待确认方法之间的灵敏度差异。灵敏度试验的样品一般选择自然和/或人为污染的样品。每类基质种类选择不少于3种不同类型的样品，每个类型测试样品的数量不少于20份。配对比较待确认方法与参考方法，分别按式（1)计算待确认方法（SEat）和按式（2)计算参考方法(SErt)的灵敏度，按式（3)计算待确认方法的相对正确度（RT)和式（4)计算假阳性率(FPR）。(PA+PD)X100%+..........(1)SEref =(PA+ND)(PA + ND + PD)X100%....(2)(PA+NA)RT=NX100%FPFPR=X100%....(4)NA式中：PA一一阳性符合，即两个方法的阳性结果相一致；PD一阳性偏离，即待确认方法为阳性结果，而参考方法为阴性结果；5

ND一一阴性偏离，及待确认方法检出阴性结果，而参考方法为阳性结果； N—样本总数(NA+PA+PD+ND); FP一假阳性结果。 配对和非配对研究的结果用于可接受性限（AL)的评估，分别计算阴性偏离（ND)和阳性偏离（PD） 之差(ND一PD)，配对研究的阴性偏离(ND)和阳性偏离(PD)之和(ND十PD)。方法确认研究的可接受 性限（AL)可参考附录A的表A.1。当结果的计算值高于AL时，则确认结果不满足AL的要求。当 AL不满足时，应对根本原因进行分析，对观察到的结果进行解释。根据AL和附件信息，确认待确认 方法适用或不适用于所分析的基质种类或类别。

4.4.1.2相对检出水平

检出水平(LOD，)是预期可以检测到目标微生物的最低含量。在本标准中，使用LODso对待确认 方法和参考方法的检出水平（LOD，）进行比较研究，并采用相对检出水平（RLOD)对待确认方法进行 评估。 RLOD的研究采用人工污染样品的方式。每类基质种类可选择1种类型的样品，且至少三种污染 水平，其中包括阴性对照，低水平和高水平。理想情况下，低水平应为理论检测水平（即每个测试部分为 D.7CFU），高水平恰好高于理论检测水平（例如每个测试部分1CFU1.5CFU）。对于阴性对照，应采 用待确认方法和参考方法测试至少五个重复样品。对于低水平，至少检测20份重复样品，对于高水平， 应测试至少五个重复样品。阴性对照应为阴性结果，当获得阳性结果时，必须对所有水平重新测试。 RLOD定义为待确认方法和参考方法的检出水平（LOD，）的比率，计算如式（5)所示：

LODt一待确认方法的检出水平； LODrer一参考方法的检出水平。 配对研究的可接受性限（AL)为1.5，即待确认方法的LOD，不得高于参考方法的LOD，的1.5倍。 未配对研究的AL设定为2.5，即待确认方法的LOD，不得高于参考方法的LOD，的2.5倍。可以接受 待确认方法的LOD，值小于参考方法的LOD，值，这表明待确认方法比参考方法可检测到的污染水平 更低。 当结果的计算值高于AL时，则确认结果不满足AL的要求。当AL不满足时，应对根本原因进行 分析，对观察到的结果进行解释。根据AL和附件信息，确认待确认方法适用或不适用于所分析的基质 种类或类别

4.4.1.3包容性和排他性

4.4.1.3.1总则

包容性和排他性所使用的每株菌株应具有足够详细的生物化学和/或血清学和/或遗传学特征。 量方法，包容性和排他性测试适用于特定微生物的计数（例如，李斯特氏菌），不适用于计数所有 总数的方法，例如菌落总数、菌和酵母计数等。

4.4.1.3.2包容性

只需要使用待确认方法进行包容性测试，在测试过程中不需要添加样品基质。包容性测试，应测 50个（目标）微生物纯培养物。测试菌株的纯培养应是在最佳生长条件下，在非选择性培养基上 处于稳定期的细胞群体。接种水平应比已确认方法的最低检出水平高10倍至100倍。当包容

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结果为阴性或可疑时，应同时用参考方法进行重复测试，分析相关菌株是否可以用参考方法进行检测。

4.4.13.3排他性

只需要使用待确认方法进行排他性测试，在测试过程中不需要添加样品基质。排他性测试，应测试 至少30个（非目标）微生物的纯培养物。测试菌株的纯培养应是最佳生长条件下，非选择性培养基上培 养并处于稳定期的细胞群体。如果待确认方法中有选择性增菌的步骤，为了排他性测试的目的，应使用 非选择性培养基替代该步骤中所使用的选择性培养基。当排他性结果为阳性或可疑时，应重复测试待 确认方法，同时对参考方法进行测试，分析参考方法是否能检出相关菌株。

4.4.1.4相对正确度

4.4.1.6定量限 LO0

只有待确认方法的谈 (LOQ)。例如，采用仪器法测定与微生物生长相关的电导率或荧光等。确定LOQ，需要用待确认方法 测试每个基质种类的空白，相同的样品至少测试10个测试单元，结果用于估计基线或阈值的标准偏差 S。。通常建议将空白值加上10倍的重复性标准偏差作为LOQ

4.4.1.7测量不确定度

需要时，可对微生物定量检测方法进行不确定度评估。 影响微生物定量分析结果的不确定度产生的因素有很多，如质量、体积、样品因素和非样品因素等。 其中样品因素，如取样（从大量的待测样品中取出测试样品）是总误差来源的重要组成部分，但它并不是 测量本身不确定度的组成部分。次级取样是指从测试样品（从大量样品中取出的单元）中取出检测的单 元，微生物计数中的初始悬液的制备属于次级取样。而非样品因素则为分析过程（包括操作者、时间、设 备、培养基和试剂等）。剩余的自由误差来源于以前未说明的因素，通常是在重复性条件下实验室内部

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进行评定时才给予考虑。 测量不确定度的评估一般不考虑偏倚

4.4.2实验室间方法研究特性参数的确认

4.4.2.1定性方法

参考方法的特异性：SPref=（1 )×100% N. 6 待确认方法的特异性：SPalt=（1 (7

4.4.2.2定量方法

5.1.1在微生物检测实验室引人标准方法时，实 足标准的要求，即证实该方法能在该实验室现有的设施设备、人员、环境条件下获得令人满意的结果，必 要时可参加能力验证或进行实验室间比对。 5.1.2如果只是对标准方法稍加修改，如使用不同制造商的同类设备或试剂等，必要时也应进行验证， 以证明能够获得满意的结果，并将其修改内容制定成作业指导文件。 5.1.3如果发布机构修订了方法，应在所需的程度上重新进行验证。 5.1.4在进行方法验证之前，应参考标准方法或已确认方法的适用范围，选择用于方法验证的基质 种类。

测试样品尽可能使用自然污染的物品，如果样品测试单元的预期自然污染水平低于10CFU/g，则 使用人工污染的方式。重复性的测定通常需要测定10个以上的测试样品。将每个测试样品均质化并 从该均质样品中取出两个测试单元，定义为测试单元A和测试单元B。 在验证方法规定的范围内，测试单元A和测试单元B的测试条件应尽量不同，应包括但不限于： a）技术人员； b）培养基和试剂； c）仪器（培养箱、涡漩混合器、移液器等）。 实验室内重复性标准偏差（s，）应小于或等于该方法在确认研究中给出的实验室间再现性标准偏差 SR）。

5.4.3测量不确定度

如果参考方法对不确定度的主要影响因素贡献值和对结果的表达方式有要求，则实验室应该满足 于同类标准的要求。 对于微生物定量检测的测量不确定度评估可参考RB/T151一2016

如果参考方法对不确定度的主要影响因素贡献值和对结果的表达方式有要求，则实验室应该满足 于同类标准的要求。 对于微生物定量检测的测量不确定度评估可参考RB/T151一2016

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硬度标准附录A （资料性附录） 定性方法确认中配对和不配对研究的可接受性限参数和限值

性方法确认中配对和不配对研究的可接受性限参

开究的可接受性限参数和限值，见表A,1。

表A.1与样品种类数量相关的配对和不配对研究的可接受性限参数和限值

与协作实验室数量相关的配对研究的可接受性限

实验室间方法确认过程中，与协作实验室数量相关的配对研究的可接受性限参数和限值： 见表A.2。

吊环标准附录B （资料性附录） 根据每个污染水平的阳性结果数量估算LODs

根据每个污染水平的阳性结果数量估计LOD