4.7.1实验室可用RSD，来评估方法的重复性。重复性的评估和真实度的评估方法相似，是在重复条 件下通过PCR平行实验进行计算。重复性适用于所有转基因水平的测试。检测条件（反应体积、PCR 仪等)应和日常检测一致，至少要得到16个独立测量结果。检测的设计实例见表1、图1和图2。标准 偏差和相对可重复性标准偏差的计算方法参见附录D。 4.7.2RSD.应小于或等于25%，并覆盖方法的动态范围

4.8.1为了建立准确的LOQrel，需要用低浓度的转基因标准样品提取DNA配制溶液。当实验室验证 LOQre时，0.1%的阳性对照样品可以用目标转基因的10次PCR平行实验和内源基因的10次PCR平 行实验进行分析。LOQrel的RSD应小于25%。 4.8.2当实验室验证LOQ.b时，1%的已知阳性对照样品的一系列稀释可以用10次PCR平行计算（如 80、60、40、20、10、5和1个拷贝）。L0Qbs可以用一系列的稀释液中的最后一个稀释度进行评估，测量 的RSD要小于25%。标准曲线应该覆盖LOQabs值。 4.8.3进行以上两个指标的验证时，概率分布建议1个拷贝应有大约30%的阴性结果。因此，1个拷贝 的稀释液至少一个平行结果应是阴性的。只要标准曲线满足R和斜率/效率的要求，10次PCR平行

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生活垃圾标准规范范本实验的平均值可作为绘制标准曲线白 标准曲线其他点的数据只需要在每个点做2个 PCR平行实验。当标准方法有规定时 节法规定的要求

4.9.1当实验室验证LOD时，一个低转基因浓度的阳性对照样品可以用10次PCR平行计算，如果 所有平行的结果都是阳性，这表示LODrel小于或等于阳性对照水平。 4.9.2当实验室验证LODabs时，计算一个方法95%置信水平的LODbs，需要每个浓度进行60个PCR 平行。由于此方法并不实用，可用计算少量平行实验的方法进行LODbs的大致评估，如10次平行实验 的假阴性率。假阴性率应小于5%，如进行10个PCR平行实验，其结果应都是阳性。 4.9.3假阴性率是指一个已知阳性样品被检测成阴性的可能性。当分析物的量接近方法的LOD时， 假阴性率会上升。基于对已知方法性能的推测，选取适宜的稀释系列，使其能代表高于和低于预期 LODbs的间隔（如20、10、5和1个拷贝）。10个平行都是阳性的最低浓度是预估的LODbs。概率分布 建议1个拷贝应有大约30%的阴性结果。因此，为了验证稀释系列正确的拷贝数，1个拷贝的稀释液至 少一个平行实验结果应是阴性的，见表1。当标准方法有规定时，LOD应优于方法规定的要求

表1定实时荧光PCR方法的验证设置实例

附录A （资料性附录） DNA提取效果的评价方法

抑制PCR反应的物质可以通过与DNA模板反应、干扰DNA聚合酶活性或降低聚合酶辅助因子 （Mg?+）的效率而影响目标DNA扩增的效率。DNA提取步骤可以在很大程度上消除或降低PCR抑制 物的量。但是，一个样品中抑制剂的最终量很大程度上取决于样品的性质。样品被加工的程度越深， DNA断裂的可能性越大。植物DNA还会受到次生代谢物如多酚、脂类和能够与DNA链聚合的多糖 的影响。DNA抑制剂还可能是DNA提取步骤中添加的试剂：如KC1和NaCI、离子洗涤剂、乙醇、异丙 醇和苯酚等。 为了在DNA的准备工作中检测是否存在PCR抑制物，可以采取不同的措施。本附录说明了如何 使用未稀释的样品提取物的反应效率（斜率和R）作为验收标准来评估PCR抑制物是否存在。 抑制的作用基本上取决于抑制物的浓度。当DNA被稀释时，抑制物的效果通常会在DNA低浓度 时被降低或消除。对连续稀释样品的反应效率的评价，可以通过不含抑制剂的未稀释样品的理论C， （临界循环次数）和测量C，的对比，可以得到评估DNA质量的信息。如果只有最高DNA浓度显示抑 制，则低浓度DNA可以用于定量，但是会影响实际的LOD和LOQ值。 但是，在特定情况下连接在DNA片段上的抑制物不会通过样品稀释而被消除，这样就会导致可以 扩增的DNA拷贝数少于样品中预期的DNA浓度

可以通过扩增内源基因序列来证明是否含有抑制剂。验证试验中选取样品的DNA提取平行，按 照1：4、1：16、1：64和1：256对其进行4倍梯度稀释，对上述每个梯度都进行2个PCR平行实验， 为了评估抑制剂是否存在，4个系列稀释的样品的C，值从稀释因子的对数中得到，并用线性回归计算 得到一个等式。从线性回归推算出的“未稀释”样品的C，值与同一个样品的测量C，值进行比较。 DNA提取可被接受的三个条件为，回归线的斜率在一3.6～一3.1之间；判定系数（R"）应大于或等于 0.98；测量C，和推算C，的差△C，应小于0.5。 每个稀释梯度得到的两个PCR平行的C.值用于A.3的评价。

不同抑制剂验证结果判定的示例，见图A.1～图A.4。 注：图中“工作稀释度”是未经稀释的样品DNA提取物

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（资料性附录） DNA提取浓度对实际LOD的影响

DNA提取浓度影响实际LOD的示例 如表B.1所示，在0.1%转基因样品中，内源基因的拷贝数是目标转基因的1000倍以上。这表示， 对于10个拷贝的绝对LOD，需要将10000个内源基因序列的拷贝进行PCR实验以得到0.1%的实际 LOD。如果绝对LOD是10个拷贝，用100000个拷贝进行PCR反应，那么实际LOD为0.01%（见表 B.1)。应该对每个样品进行实际LOD的计算

表B.1DNA含量对实际LOD影响的示例

附录C （资料性附录） 中间浓度阳性对照的制备

基于实时荧光PCR估计转基因DNA的百分比分别需要检测转基因目标DNA序列的拷贝数和检 则内源基因DNA序列的拷贝数。转基因DNA含量百分比的估计按式(D.1)计算：

转基因含量==×100%

工一一转基因目标DNA序列的拷贝数； y一一内源基因DNA序列的拷贝数。 将目标和内源基因一式两份或一式三份来进行实验，得到2或3个转基因目标DNA序列和内源 基因DNA目标序列的检测结果，然后根据这两组检测结果计算转基因百分比的平均值。平均值用 式(D.2）计算，方差用式(D.3)计算，标准偏差用式(D.4)计算，相对可重复性标准偏差RSDr用成分的 标准偏差计算，见D.2。

E[]~ 毫+Var() (D.2) V 元2 （D.3) y2 sd[X/Y]=/Var[X/Y] D.4

式中： E 平均值； Var 方差； sd 标准偏差： X 转基因目标DNA序列的拷贝数； Y 内源基因DNA序列的拷贝数； IHI 目标转基因DNA拷贝数的算术平均值； 内源DNA拷贝数的算术平均值。

以下示例用工表示转基因目标基因的拷贝数，用y表示内源基因拷贝数。示例对应表1中给出的 实验设计实例。示例演示了计算方法。 示例D.1：两个DNA提取，每个提取的转基因目标和内源基因都在四个PCR反应板上通过两个PCR平行进行 测试。 本示例中一个反应板中得到两个转基因平均值和标准偏差的结果，4块反应板总共有8个转基因 平均值（GM～GMg）和8个标准差（sd;～sdg）。这8个转基因平均值和标准差都是使用目标基因拷贝 数和内源基因拷贝数两个测试结果代入公式D.2、D.3、D.4中求得。

表D.1图1实验设计中提取1得到的转基因且标基因和内源基因C 值及拷贝数

注：提取1指本标准图1中的实验设计。

根据表D.1计算得出，工=15036.97，y=163977，Var（r）=2343612.5，Var（y）=104 将结果代人式（D.2）得出平均值GM，为0.092或9.2%；代人公式D.3、D.4得到标准 0.010943

表D.2图1实验设计中提

注：提取2指本标准图1中的实验设计。

根据表D.2计算得出，=13702.5，y=166498，Var(x）=177012.5，Var（y）=62518562。将结 果代人式(D.2)得出平均值GM2为0.082或8.2%；代人式(D.3、式(D.4)得到标准差sd2为0.004654。 使用四个不同的PCR反应板得到的数据按照上面的过程进行计算，除了GM1、GM2、sd，和sd2，还 得到平均值GMs、GM,GMg和标准差sds，sd,sdg。 样本转基因的总体平均值GM可以通过GM,～GM。的算术平均值计算，见式(D.5)

GM=GM,/8 0000000000000

风T sdGM—整体平均的标准差。 在示例D.1中分母是16一8=8。相对可重复性标准差的计算，见式(D.7)：

sdeM×100 RSD, = GM

RSD,= SdGM ×100 0000000c00c06 GM

示例D.2：两个DNA提取，每个提取的转基因目标和内源基因都在两个PCR反应板上通过四个PCR平行进

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本示例中一个反应板中得到两个转基因平均值不 的结果，2块反应板总共有4个转基因 平均值GM,～GM和4个标准差（sd～sd）。这4个转基因平均值和标准差都是使用目标基因拷贝 数和内源基因拷贝数4个测试结果带入式(D.2)、式(D.3)、式(D.4)中求得

表D.3图2实验设计中提取1得到的转 因且标基因和内源基因C.值及拷贝数

注：提取1指本标准图2中的实验设计

根据表D.3计算得出，=14369.5，y=165237.5，Var(x）=1433394，Var(y）=57700642。将 结果代人公式D.2得出平均值GM为0.087或8.7%；代人式（D.3)、式（D.4)得到标准差sd为 0.00828。

根据表D.3计算得出，=14369.5，y=165237.5，Var(r）=1433394，Var(y）=57700642 果代入公式D.2得出平均值GM，为0.087或8.7%；代人式（D.3）、式（D.4)得到标准差sd 00828。

计中提取2得到的转基因且标基因和内源基因 C

住宅楼标准规范范本注：提取2指本标准图2中的实验设计。

根据表D.4计算得出，=14187，y=157308，Var(α）=747515，Var(y）=89272181。将结果代 人公式D.2得出平均值GM2为0.091或9.1%；代人式(D.3)、式（D.4)得到标准差sd2为0.0077。 使用两个不同的PCR反应板得到的数据按照上面的过程进行计算，除了GM、GM2、sd，和sd2，还 得到平均值GMs、GM，和标准差sds、sd。 样本转基因的总体平均值GM可以通过GM,～GM的算术平均值计算，见公式D.8：

式中： GM——样本转基因的总体平均值； GM一第i个转基因平均值。 整体平均的标准差计算，见式(D.9)：

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式中： n—每个提取的平行数； k—每个反应管分别的标准差数量； 在这个示例中分母是16一4=12。 相对可重复性标准差的计算,见式(D.10)：

式中： n——每个提取的平行数； —每个反应管分别的标准差数量； 在这个示例中分母是16一4=12。 相对可重复性标准差的计算，见式(D.10)

RSD,= ...(D.10 GM

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