9.1样品采集、保存和运输

9.1.1样品采集应经过伦理审查和生物安全评价审查。 9.1.2应即刻采样，减少样品暴露于空气中的时间，同时应避免样品被其他物质污染。 9.1.3应根据环境样品类型等情况选择相应的采样方法以保证样品中微生物群落的代表性和准确性 粪便样品采集、保存和运输方法按附录A，土壤样品采集、保存和运输方法按附录B，水体样品采集、保 存和运输方法按附录C执行

应核对样品编号，记录样品信息，检查样品状态，避免密封不严导致泄漏或污染等，否则该样品应房 弃混凝土结构，重新采样。应记录样品信息（见附录D），以保证样品的可追溯性

10.1.2DNA样品浓度和完整性检测

环境样品提微生物基因组DNA后：应便用炭光定量仪微测DA样品浓度，使用媒脂糖群股目 泳法检测DNA样品完整性。宜综合DNA样品浓度及完整性，判断DNA样品质量级别，判断依据见 附录E。

10.2文库构建与高通量测序

表1进行文库构建的DNA样品类别选择标准

10.3.1.1质控步骤

样品经过高通量测序得到的原始数据，应进行质量控制，去除含接头或低质量的序列、外源或宿主 基因组序列，再进行后续生物信息学分析

1.2碱基识别质量值要求

测序完成后，应进行Q20、Q30的统计和评估。每个DNA样品可用数据对应的碱基识别质量值应 符合如下要求： 一大于Q20的碱基比例≥90%； 大于Q30的碱其比例≥80%

10.3.1.3可用数据量要求

可用高质量序列数目应大于1×10°条。 注：序列数目为单端测序序列条数，或双端测序序列对数

10.3.3序列拼接与组装

使用组装软件将序列进行拼接，得到更长的叠连 群，将这些叠连群片段聚集起来，与参考数据库进行比对，得到新的参考基因集。数据库见附录F。

10.3.4微生物物种相对丰度计算

数据质控后对样品数据进行物种相对丰度计算，应对所使用的相对丰度计算方法进行记录。除特 殊方法外，宜将可用高质量测序数据比对到组装好的参考基因集或合适的数据库上，按相似度95%以 ，覆盖度90%以上进行统计，得到基因水平上的相对丰度分布情况，再将注释到同一物种分类水平的 焦因序列相对丰度进行叠加，得到该物种的相对丰度结果

12.1宜使用标准物质进行质量控制，评估定性与定量检测结果的准确性。 12.2在描述结果时应注明检测结果的局限性，说明非本文件规定的可能影响检测结果的所有操作 细节。

12.1宜使用标准物质进行质量控制，评估定性与定量检测结果的准确性。 12.2在描述结果时应注明检测结果的局限性，说明非本文件规定的可能影响检测结果的所 细节。

附录A （规范性） 粪便样品采集、保存、运输方法

应使用洁净的器血收集粪便样品，确认器皿中无水、尿液或其他分泌物（如经血)等污染。排便后即 创使用一次性粪便杯配套取样勺对粪便样品中部取样，将粪便样品从洁净器皿转移至粪便杯，立刻旋紧 盖子。每个粪便杯中转移至少2cm大小的粪便样品

A.1.2.1粪便杯采集粪便样品后，应立即置于干冰或一80℃保存。若不能即刻转移，可暂存于≤4℃ 条件下（如冰盒），30min内转移至干冰或一80℃保存。 A.1.2.2应在干冰条件下进行运输。保存及运输过程应避免反复冻融

A.2含稳定液自采样套装采集法

应使用洁净的器皿收集粪便，确认器皿中无水、尿液或其他分泌物（如经血)等污染，按照自采样套 装操作要求取中段粪便，将采集的粪便样品迅速转移至含有稳定剂的保存管中，使稳定液完全浸没粪便 样品，盖紧管盖。

含稳定液保存管采样后，该保存管按操作 保存和运输，避免阳光直射。常温放置时间 应不超过自采样套装操作说明限定的常温保存时间范围。对将超出自采样套装操作说明限定时间的常 温粪便保存管需转移至一80℃冻存，应在干冰条件下进行运输。保存及运输过程应避免反复冻融。

（规范性） 土壤样品采集、保存、运输方法

宜取土壤表层5cm～10cm处土壤，如果土壤有翻动，应更深处采样，避免空气微生物污染。采样 区内设置至少3个重复采样点，保证所取样本对所在地域的代表性。每个点取样量应一致（≥5g），去 除土样里植物根系或砾石，将重复土样混合均匀，做好标记，装人灭菌封口聚乙烯袋或其他无菌容器

B.2.1采集样品后，应立即置于干冰或一80℃保存。若不能即刻转移，可暂存于≤4℃条件下（如冰 盒），30min内转移至干冰或一80℃保存。 B.2.2应在干冰条件下进行运输。保存及运输过程应避免反复冻融。如需常温保存或运输，宜将样品 浸润于稳定剂中。

采集样品后，应立即置于干冰或一80℃保存。若不能即刻转移，可暂存于≤4℃条件下（如冰 min内转移至干冰或一80℃保存。 应在干冰条件下进行运输。保存及运输过程应避免反复冻融。如需常温保存或运输，宜将样品 稳定剂中

附录C （规范性） 水体样品采集、保存、运输方法

C.1.1根据水体不同的浊度，应使用无菌器材采集4L～200L不等的水样。采集好的水样需要通过 虑膜进行过滤，可选择不同孔径大小的滤膜。 示例：20μm、3μm、0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm等孔径滤膜。 C.1.2浊度较大水样应先静置，分离悬浮颗粒；再使用20um孔径滤膜预过滤，再选择小孔径滤膜进行 过滤。浊度较小清凉水样，可选择小孔径滤膜直接过滤

C.1.1根据水体不同的浊度，应使用无菌器材采集4L～200L不等的水样。采集好的水样需要通过 虑膜进行过滤，可选择不同孔径大小的滤膜。 示例：20μm、3μm、0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm等孔径滤膜。 C.1.2浊度较大水样应先静置，分离悬浮颗粒；再使用20um孔径滤膜预过滤，再选择小孔径滤膜进行 过滤。浊度较小清凉水样，可选择小孔径滤膜直接过滤

C.2.1样品最后一次过滤后的滤膜应放置于无菌容器，并将无菌容器立即置于干冰或一80℃进行保 存。若不能即刻转移，可暂存于≤4℃条件下（如冰盒）建筑技术论文，30min内应转移至干冰或一80℃保存。 C.2.2应在干冰条件下进行运输。保存及运输过程中应避免反复冻融。如常温保存或运输，宜将样品 浸润于稳定剂中

C.2.1样品最后一次过滤后的滤膜应放置于无菌容器，并将无菌容器立即置于干冰或一80℃进行保 存。若不能即刻转移，可暂存于≤4℃条件下（如冰盒），30min内应转移至干冰或一80℃保存。 C.2.2应在干冰条件下进行运输。保存及运输过程中应避免反复冻融。如常温保存或运输，宜将样品 漫润于稳定剂中

E.1 DNA 完整性判断

E.2DNA质量级别分类

DNA样品的完整性图谱和质量级别分类

图E.1基因组DNA样品降解程度示意图

数据标准表E.1DNA样品质量级别分类表