GB/T403922021

在真空过滤系统上安装微孔滤膜，取水样上清液200mL～1000mL过滤，记录过滤水样的体积 Vto。过滤后取下滤膜，置于带盖的无菌容器中，用无菌剪刀剪碎，加15.0mL无菌水，放入涡旋混合器 振荡至少2min（也可将容器放人超声波振荡器中振荡2min～10min，稀释液液面应低于超声波振荡 器水面）充分洗脱，作为浓缩液备用，记录体积V。。 当样品中军团菌的菌落数量超过105CFU/L时，可不进行样品浓缩处理，计数时按直接涂布法 计数。

9.2.1将9.1.2的浓缩液（无需浓缩时取原液）分成三份。其中一份不做处理，另两份分别采用热处理 和酸处理方式处理。 9.2.2热处理：移取1.0mL浓缩液（或原液）于一无菌容器中，置于50℃士1℃的水浴中加热30min 9.2.3酸处理：移取3.0mL浓缩液（或原液）于一无菌容器中，加入3.0mL酸缓冲液摇匀，其pH值约 为2.2.放置5min

经处理、热处理、酸处理样品各0.1mL市政图纸、图集，用无菌涂布器 种液均匀涂布于相对应的GVPC培养基平皿的整个表面

将已接种的平板倒置放人CO2培养箱中，调节CO2浓度为2.5%，温度为36℃土1℃，相对湿度 于95%,培养10 d。

培养期间，在第三天开始检查培养皿，并在培养期结束时进行最终检查，记录可疑军团菌菌落的数 量。在平板上生长小于300个菌落为宜，如有天量军团菌生长，则应减少过滤样品的体积或稀释浓缩 液。军团菌的生长可能被其他菌掩盖或抑制，如果怀疑军团菌被抑制应重新处理水样进行培养。 典型的军团菌菌落通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也可能出现棕色、灰绿色、深红色。菌落表面光 滑，边缘整齐，呈典型毛玻璃状。在紫外光下有荧光，荧光的颜色有助于区分样品中军团菌的不同种类。 为了避免军团菌的死亡，不能将平板长时间暴露在紫外灯下，宜在数秒内完成，

GB/T 403922021

9.7嗜肺军团菌的鉴定

水样中军团菌的计数以每升样品中的菌落数X计，单位为菌落形成单位每升（CFU/L），按公 式（1）计算：

/V 1 N X1000

GVPC培养基上疑似军团菌的菌落数，单位为菌落形成单位（CFU)； 确认的军团菌菌落数，单位为菌落形成单位（CFU)； N 培养基上挑取的疑似军团菌菌落数，单位为菌落形成单位（CFU）； V 一接种的原液的体积的数值，单位为毫升（mL）（原液、热处理样品：V=0.1；酸处理样品： V=0.05)

水样中军团菌的计数以每升样品中的菌落数X计，单位为菌落形成单位每升（CFU/L)，按公 式（2）计算：

.V. N VV. X1000 ( 2

GVPC培养基上疑似军团菌的菌落数，单位为菌落形成单位（CFU)； N 确认的军团菌菌落数，单位为菌落形成单位（CFU）； N 培养基上挑取的疑似军团菌菌落数，单位为菌落形成单位（CFU)； V。 量取的无菌水的体积的数值，单位为毫升（mL）（V。=15.0）； V 接种的浓缩液的体积的数值，单位为毫升（mL）（未经处理的浓缩液样品、热处理样品 V=0.1；酸处理样品V=0.05)； Vot 过滤水样的体积的数值，单位为毫升（mL）。

分别对未经处理、热处理和酸处理样品接种后培养出的军团菌的数量按照公式（1)或公式（2)进 算，取结果的最大值作为该水样中军团菌的数量X，此数值为此份样品中军团菌的最大可能数，

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1经检测水样中未见军团菌可疑菌落生长时，在检测报告中注明“未检出军团菌”，并注明检测水 积。 2经检测并确认存在军团菌时，在检测报告中注明“检出军团菌”。如需标注军团菌数量时，给出 菌的数量X（CFU/L）。 3经鉴定为嗜肺军团菌时，在检测报告中注明“检出嗜肺军团菌”并给出其血清分型。如需标注 军团菌数量时，给出嗜肺军团菌数量X（CFU/L）

11.1经检测水样中未见军团菌可疑菌落生长时，在检测报告中注明“未检出军团菌”，并注明检测水样 体积。 11.2经检测并确认存在军团菌时，在检测报告中注明“检出军团菌”。如需标注军团菌数量时，给出军 团菌的数量X（CFU/L）。 11.3经鉴定为嗜肺军团菌时，在检测报告中注明“检出嗜肺军团菌”并给出其血清分型。如需标注嗜 肺军团菌数量时.给出嗜肺军团菌数量X（CFU/L）

A.1.2.1半胱氨酸和焦磷酸铁的溶解

A.1.2.2ACES缓冲液

将ACES颗粒加入到500mL水中，于45℃～50℃水浴溶解。另取480mL水溶解氢氧化钾，轻 遥溶解，将两种溶液混匀

A.3选择性培养基（GVPC培养基）

注：此培养基是在BCYE的基础上再加人三种抗生素及甘氨酸。

A.3.1选择性添加剂

GB/T403922021

A.3.2抗生素添加剂的制备

A.3.2.1取适量的多粘菌素B(一般为200mg)溶解于100mL水中，使其浓度为145451U/mL。混匀 后进行膜过滤除菌。用无菌管进行分装，每管5.5mL，于一25℃～一15℃保存。使用时，放至室温后 再用。 A.3.2.2取20mg万古霉素盐酸盐溶解于20mL水中，混匀后，进行膜过滤除菌。用无菌管进行分装， 每管1mL，于一25℃～一15℃保存。使用时，放至室温后再用。 A.3.2.3取2g放线菌酮溶解于100mL水中，混匀后，进行膜过滤除菌。用无菌管进行分装，每管 4mL，于一25℃～一15℃保存。使用时，放至室温后再用。 A.3.2.4以上抗生素添加剂冷冻保存最长时间为6个月

A.3.3GVPC培养基的制备

A.4.2.1溶液 A:0.2 mol/L 盐酸

在1L水中加人17.4mL浓盐酸.混勾。于121℃±1℃高压蒸汽灭菌15min

A.4.2.2溶液B:0.2mol/L氯化钾

将14.9g氯化钾溶解于1L水中，于121℃土1℃高压蒸汽灭菌15min。

A.4.2.3酸缓冲液

取3.9mL溶液A和25mL溶 mol/L氢氧化钾调节pH值到2.2土0.2，置于具 皮璃瓶中，该溶液在室温下避光放置不超过1个月

四甲基对苯二胺盐酸盐

四甲基对苯二胺盐酸盐

使用前迅速将上述成分溶于水中。

4.6.3硝酸盐还原试剂

蛋白陈 氯化钠 葡萄糖 磷酸二氢钾 0.4%酚红溶液 琼脂 水 20%尿素溶液

蛋白陈 氯化钠 葡萄糖 磷酸二氢钾 0.4%酚红溶液 琼脂 水 20%尿素溶液

将除尿素和琼脂以外的成分配好，并校正pH值，加入琼脂，加热溶化并分装烧瓶，于121℃土1 灭菌15min。冷却至50℃～55℃，加人经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度应为2%，最 值应为7.2士0.1。分装于灭菌试管内，放成斜面备用

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加热溶解、校正至pH值7.4～7.6，分装小管，于121℃土1℃高压蒸汽灭菌10min，取出后迅速 使其凝固，最终pH值应为6.8~7.0。

1.9.11%马尿酸钠溶液

A.9.23.5%（水合）节三酮溶液

（水合）三酮（ninhydrin） 丙酮 工醇

范三酮溶解于丙酮/丁醇混合液中。该溶液避光冷

1.0 g 100mL

嗜肺军团菌作为军团菌中重要检测对象，在特定情况下应进一步用生化培养和血清学试验鉴定 军团菌。

B.2.1军团菌胶乳凝集试剂盒气象标准，市售。 B.2.2嗜肺军团菌诊断血清，市售。 B.2.3氧化酶试剂：按A.5制备或采用市售成品。 B.2.4硝酸盐培养基：按A.6制备或采用市售成品 B.2.5尿素琼脂：按A.7制备或采用市售成品 B.2.6营养明胶：按A.8制备或采用市售成品。 B.2.7马尿酸水解试剂：按A.9制备或采用市售成品

B.2.1军团菌胶乳凝集试剂盒，市售。 B.2.2嗜肺军团菌诊断血清，市售。 B.2.3氧化酶试剂：按A.5制备或采用市售成品。 B.2.4硝酸盐培养基：按A.6制备或采用市售成品 B.2.5尿素琼脂：按A.7制备或采用市售成品。 B.2.6营养明胶：按A.8制备或采用市售成品。 B.2.7马尿酸水解试剂：按A.9制备或采用市售成品

B.2.1军团菌胶乳凝集试剂盒，市售。

B.3.1细菌形态观察：对菌落进行革兰氏染色镜检，观察细菌形态及颜色。如果菌体呈紫色，为革兰氏 阳性菌；菌体呈红色，为革兰氏阴性菌。 B.3.2氧化酶试验：使用铂/铱接种环或玻璃棒，挑取待测菌落于滤纸上，加一滴氧化酶试剂。如果在 30s内出现紫罗兰色或深蓝色为阳性；2min不变色为阴性。 B.3.3硝酸盐还原试验：将待测菌接种到硝酸盐培养基上，于36℃士1℃培养1d～3d，加人甲液和乙 液各一滴，观察结果。立刻或数分钟内显红色为阳性；培养基颜色无变化为阴性。 注：本试验阴性的原因有三个：细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长 如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加人锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色 B.3.4尿素酶试验：将待检菌以较大量穿刺接种在尿素琼脂培养基上，于36℃士1℃培养2h、4h、 24h，分别观察结果。培养基变为红色为阳性；颜色不变为阴性。 B.3.5明胶液化试验：将待测菌穿刺接种在明胶培养基内，于36℃土1℃培养24h士2h，取出放置于 4℃士2℃冰箱内10min～30min后再观察结果。仍呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化试验阳性； 凝固不溶者为阴性。 B.3.6马尿酸水解试验：挑取待测菌落，加到盛有0.4mL1%马尿酸钠的试管中制成菌悬液。混合均 匀后于36℃士1℃水浴中温育或36℃土1℃培养箱中培养24h。沿着试管壁缓缓加人0.2mL节三 酮溶液，于36℃土1℃水浴中温育或36℃土1℃培养箱中放置10min后观察结果。15min内溶液出 现蓝紫色变化则为阳性；溶液无颜色变化或15min之后出现蓝紫色变化为阴性。试验时为了避免假阴 生需用标准菌株做阳性对照。 B.3.7生化培养结果判定：染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，且氧化酶（一/弱十），硝酸盐还原（一）， 尿素酶（一），明胶液化（十）和水解马尿酸（十），即可确定为嗜肺军团菌。

特种设备标准GB/T403922021

当军团菌乳胶凝集试剂盒中的乳胶颗粒与含军团菌或者从相关的军团菌加热灭活的抗原的悬液混 合后，发生免疫化学反应，使乳胶颗粒迅速凝集，根据凝集结果对血清型进行初筛分类