图2枯草芽孢杆菌黑色变种染色镜检图

挑取黑色或可疑菌落（8.3.2），分别接种到淀粉培养基（5.3）、硝酸盐还原培养基（5.4）、甘油 复红肉汤培养基（5.5）、甘露糖生化培养基（5.6）、甘露醇生化培养基（5.7）和苦杏仁苷生化培养 基（5.8）上，操作步骤及结果观察见附录B，若使用市售商品化培养基， 则按使用说明书操作。

用无菌水（5.16）按照步骤8.2和8.3进行实验室空白对照试验。 培养96h后平板培养基上应无菌落生长，否则，该次样品鉴定结果无效，应查明原因后重新采样 和检测。

8.5.2阴性及阳性对照

将阴性对照菌（5.11）和阳性对照菌（5.12）制成浓度为40CFU/L～600CFU/L的菌悬液，分别 按照8.2～8.4步骤操作。阴性、阳性对照菌呈现的生化反应结果应与表1所列结果一致，否则该次样 品鉴定结果无效房地产标准规范范本，应查明原因后重新采样和检测

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表1阴性、阻性对照菌应呈现的生化反应结

6家实验室分别对枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液（以芽孢计）高浓度（10°CFU/100ml）、中浓度 104CFU/100ml）、低浓度（102CFU/100ml）样品进行方法灵敏性检测，结果显示枯草芽孢杆菌黑色 变种的检出率均为100%。

6家实验室分别对枯草芽孢杆菌黑色变种阳性对照组和地衣芽孢杆菌阴性对照组进行方法特异 则，结果显示阳性对照组枯草芽孢杆菌黑色变种的检出率为100%，阴性对照组中枯草芽孢杆菌 中的检出率为0。

11质量保证和质量控制

详品均应进行空白对照试验、阴性对照试验、阳

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2每20个样品或每批次样品（≤20个/批）检测一个平行样，若平行样与原样品的结果不一致 本批次试验无效，需重新检测。 3应使用有证标准菌株对每批次培养基进行质量检验。

实验产生的废物经121℃高压蒸汽灭菌20min～30min后，依法委托具备相应资质的！ 置。

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A.1酪氨酸琼脂培养基

将除璟脂以外的各成分溶解于蒸馏水申，按配方顺序逐一加入营养成分，待一种成分溶解后加入另 种成分，调节pH值至7.0左右。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂融化，121℃高压蒸汽灭菌15min。 待冷却至50℃～55℃，每个培养皿内分别倾注25ml～30ml培养基，待用。

将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，调节pH值至7.2～7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂融 化，121℃高压蒸汽灭菌15min。待冷却至50℃～55℃，每个培养皿内分别倾注15ml～25ml培养

A.3淀粉培养基和碘液

A.3.1.2制备方法

将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，调节pH值至7.2～7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂 121℃高压蒸汽灭菌20min。待冷却至50℃～55℃，每个培养皿内分别倾注15ml～25ml培 待用。

将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，调节pH值至7.2～7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂融 化，121℃高压蒸汽灭菌20min。待冷却至50℃～55℃，每个培养皿内分别倾注15ml～25ml培养 基，待用。

碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 ml

A.3.2.2配制方法

将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。

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A.4硝酸盐还原培养基和相关试剂

A.4.1硝酸盐还原培养基

A.4.1.2制备方法

A.4.2格里斯氏（Griess）试剂

A.4.2.2配制方法

A.4.3 二苯胺试剂

A.4.3.2配制方法

将二苯胺溶于浓硫酸中，缓慢转移至20ml蒸馏

A.5甘油复红肉汤培养基

取蛋白陈、无水氯化镁和无水硫酸钾加入蒸馏水中，微温溶解，调节pH值至7.2～7.4，加 加热溶解，混匀，分装于试管中，每管3ml～4ml，121℃高压蒸汽灭菌20min。

A.6甘露糖生化培养基/甘露醇生化培养基

将以上成分加热溶解，调节pH值至7.0～7.2，分装于试管中，培养基高度约4cm～5cm，112 蒸汽灭菌30min。其中，溴甲酚紫（0.04%）配制方法为：称取0.1g溴甲酚紫，滴加0.1mo 瓦化钠溶液1.85ml，使之溶解，然后加蒸馅水定容至250ml

A.7苦查仁苷生化培养基

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将以上成分加热溶解，调节pH值至6.06.3，分装于试管中，每管3ml～4ml，121℃灭菌 其中，溴甲酚紫（1.6%）配制方法为：称取1.6g溴甲酚紫，滴加无水乙醇使之溶解，然后 醇定容至100ml。

A.8.1结晶紫染色液

A.8.1.2配制方法

工 A.8.2 单三氏碘液 0 A.8.2.1成分 碘 碘化钾 2.0g 蒸馏水 300ml A.8.2.2 配制方法 将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。 A.8.3 沙黄复染液 A.8.3.1 成分 沙黄 0.25g 95%乙醇 10ml 蒸馏水 90ml

A.8.2.2配制方法

A.8.3.2配制方法

将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释

A.9.1饱和孔雀绿水溶液

A.9.2.2配制方法

将番红加入蒸馏水中充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水定容至100ml。

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附录B （规范性附录） 培养基和染色液使用说明及结果观察

将待检菌接种于淀粉培养基（A.3.1）上，36℃土1℃培养2d，形成明显菌落后，在平板培养基 上滴加碘液（A.3.2）。

B.2硝酸盐还原培养基

当培养液中滴加A液、B液后。溶液如变为粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等表示有亚硝酸盐存 在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，可滴加1～2滴二苯胺试剂（A.4.3），此时如呈蓝色反应， 则表示培养液中仍有硝酸盐，且无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原作用出口产品标准，为硝酸盐还原阴性；如不 呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质，故仍按硝酸盐还原阳性处理。

B.3甘油复红肉汤培养基

B.4甘露糖生化培养基/甘露醇生化培养基

将待检菌分别穿刺接种于甘露糖生化培养基（5.6）和甘露醇生化培养基（5.7），36℃土1℃ 1d~5d后观察。

B.5苦杏仁苷生化培养基

镜检硬度标准，菌体呈蓝紫色为革兰氏阳性菌，呈红色为革兰氏阴性菌。

芽孢染色按照以下步骤操作： a）将生有芽孢的菌落涂片，火焰上固定，用饱和孔雀绿水溶液（A.9.1）染色10min，水洗： b）滴加0.5%番红溶液（A.9.2）复染30s，水洗，晾干、镜检。

镜检，菌体呈红色，芽孢呈绿色。