HJ 1216-2021  水质 浮游植物的测定 0.1ml 计数框-显微镜计数法

7. 1. 2 定量样品

按照GB/T14581、HJ/T91和HJ494的相关规定进行定量样品的采集。 用采水器（6.3）采集样品至定量采样瓶（6.4）中，一般采集不少于500ml样品。若水体透明度较 高，浮游植物数量较少时，应情增加采样体积。定量样品采集后，样品瓶不应装满，以便摇匀。 注1：有些浮游植物（如蓝藻）常浮于水面或成片、条带分布，可在此水华密集区域采样作为峰值参考。 注2：定量样品采集应在定性样品采集之前。应保持固定时间段采样，以便结果之间可相互比较

建筑工程标准规范范本7. 2. 1 定性样品

定性样品采集后立即加入鲁哥氏碘液（5.5），用量为水样体积的1.0%～1.5%。镜检活体样品不加 鲁哥氏碘液固定。定性样品在室温避光条件下可保存3周；1℃～5℃冷藏避光条件下可保存12个月。 活体样品在4℃～10℃避光条件下可保存36h

定量样品采集后立即加入鲁哥氏碘液（5.5）固定，用量为水样体积的1.0%～1.5%。也可将鲁哥氏 碘液（5.5）提前加入定量采样瓶（6.4）中带至现场使用。定量样品在室温避光条件下可保存3周；1℃~ 5℃冷藏避光条件下可保存12个月。 样品在保存过程中，应每周检查鲁哥氏碘液（5.5）的氧化程度，若样品颜色变浅，应向样品中补 加适量的鲁哥氏碘液（5.5），直到样品的颜色恢复为黄褐色， 注：若样品需长期保存，应加入甲醛溶液（5.3），用量为水样体积的4%，

每次取样前，采用上下颠倒至少30次的方式充分混匀所采样品，混匀动作要轻

在显微镜（6.5）下观察定性样品（7.1.1）， 鉴定浮游植物的种类。优势种类鉴定到种，其他种类至 少鉴定到属。部分物种鉴定参考资料见参考文献， 注：种类鉴定除用定性样品观察外，还可吸取已完成计数的定量样品进行观察

8. 3. 1 试样制备

8.3. 1. 1预检

将样品放至室温，用微量移液器（6.9）取0.1ml混匀样品，注入0.1ml浮游植物计数框（6.10） 中，用盖玻片（6.11）将计数框（6.10）完全盖住，静置片刻，无气泡可观察样品，如有气泡应重新取 样。随机选取若干计数小格或视野，初步估计浮游植物的数量。 对于含有细胞聚集成团的浮游植物样品，当不满足以下两个条件中的任何一个时，应进行超声波分 教处理： a） 群体中的浮游植物细胞个体较易被辨识，能够对群体中的细胞进行计数； b） 当群体中所含细胞数量与群体体积或长度有固定比例时，如空星藻、盘星藻、丝状藻等，可以 将群体作为计数对象，依据比例得到浮游植物细胞数量。

8.3.1.2调整浮游植物密度

适宜测定的浮游植物密度为10°cells/L～108cells/L。若定量样品（7.1.2）申的浮游植物细胞密度低 于107cells/L，应浓缩样品；若定量样品（7.1.2）中的浮游植物细胞密度高于10°cells/L，应稀释样品。 最终使加入计数框中的0.1ml样品约含有500个～10000个浮游植物细胞。 样品浓缩：将全部定量样品摇匀倒入浓缩装置（6.6）中，避免阳光直射的环境下，静置48h。用 细小虹吸管吸取上清液置于烧杯中，直至浮游植物沉淀物体积约20ml。旋开浓缩装置（6.6）底部活塞， 将浮游植物沉淀物放入100ml量筒中。用少许上清液冲洗浓缩装置（6.6）1～3次，将冲洗水一并放入 量筒中，再用上清液定容至所需浓缩倍数的体积。为了减少浮游植物吸附在浓缩装置壁上，在静置初期， 应适时轻敲浓缩装置器壁。虹吸过程中，吸液口与浮游植物沉淀物间距离应大于3cm。如水样中浮游 值物密度极低，采样量1L及以上时，可多次浓缩，即每次浓缩后再静置24h～48h，重复浓缩操作， 周整至所需浓缩倍数体积。浓缩后的样品可根据需要，经超声处理后计数。 样品稀释：根据稀释倍数，选取相应体积的容量瓶，量取不少于25ml混匀后的定量样品或经超声 分散处理后的样品，用水定容至刻线。如要保存稀释后的样品，应注意补充鲁哥氏碘液（5.5），使稀释 后的样品中的鲁哥氏碘液浓度与稀释前一致。 注：超声波分散处理具体步骤为取混匀的定量样品于样品瓶（6.7）中，用超声波发生装置（6.8）处理约10min后， 在显微镜（6.5）下观察，如仍存在大量未分散的细胞团，则应延长超声波处理时间，直至能够准确计数。超 声波分散处理过程中应注意水温，防止过热造成水分蒸发和浮游植物细胞结构被破坏

8. 3. 2. 1装片

用滴管吸取少许丙三醇（5.4）均匀涂抹盖玻片四周， 十数框水分蒸发形成气泡。涂抹时应避免渗入计数框

8.3.2.2选取计数方式

根据调整后样品（8.3.1.2）中浮游植物的密度，选用一种适当的计数方式，使测定过程中浮游机 包的总计数量为500个～1500个。表1为推荐选用的计数方式。

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表1推荐选用的计数方式

8. 3. 2. 3计数

8.3. 2.3. 1全片计数方式

在40×物镜下，逐一观察浮游植物计数框中全部100个小方格，分类计数每个小方格内所有 勿细胞，并记录每行的分类计数结果。若浮游植物细胞体积较大时，可降低物镜倍数。

8.3.2.3.2行格计数方式

在40×物镜下，逐一观察浮游植物计数框中第2、5、8行，共30个小方格，分类计数每个小 斤有浮游植物细胞，并记录每个小格的分类计数结果。若浮游植物细胞体积较大时，可降低物镜倍装

8.3.2.3.3对角线计数方式

在40×物镜下，逐一观察位于浮游植物计数框对角线位置上的10个小方格，分类计数每个小 斤有浮游植物细胞，并记录每个小格的分类计数结果。若浮游植物细胞体积较大时，可降低物镜倍

8.3.2.3.4随机视野方式

在40×物镜下，随机抽取一定数量的视野，分类计数每个视野内所有浮游植物细胞，并记录每个 视野的分类计数结果。若浮游植物细胞体积较大时，可降低物镜倍数。计数前应测量或计算显微镜视野 面积，测量和计算方法参见附录B。

8.3.2.3.5计数要求

每一样品装片计数两次。两次浮游植物细胞总计数量结果相对偏差应在土15%以内，否则应增加计 数一次，直至某两次计数结果符合这一要求为止。测定结果为相对偏差在土15%以内的两次计数结果的 平均值。

式：N一 样品中浮游植物的密度，cells/L；

式中：N—样品中浮游植物的密度，cells/L；

A。一计数面积，当计数方式为对角线、行格和全片时计数面积分别为A/10、3A/10和A，当 计数方式为随机视野时计数面积为总视野面积，mm； 显微镜观察计数的浮游植物细胞数，cells； V一计数框容积，ml; Vi一一稀释或浓缩后的试样体积，ml； Vo一—稀释或浓缩前的样品体积，ml； 1000—体积换算系数，ml/L

测定结果以科学计数法表示，保留2位有效数字。

6家实验室分别用全片计数、行格计数、对角线计数和随机视野计数对浮游植物密度水平分别为 1×107cells/L、3×107cells/L、5×107cells/L、1×108cells/L的湖泊样品进行了7次重复测定，实验室 内的相对标准偏差分别为2.4%～11%，2.9%～10%，2.7%～11%，4.8%8.2%；实验室间相对标准偏 差分别为22%、5.6%、7.1%、21%。计算测定结果对数值的95%置信区间，再取反对数得到的实验室 间95%置信区间见表2。

表2实验室间95%置信区间

11质量保证和质量控制

11.1浮游植物均匀性

在开始显微镜计数前，应确认浮游植物在计数框中分布的均匀性。使用低倍数物镜观察浮游植生 计数框中的分布情况，若分布不均匀，应重新取样。

在单次测定中，浮游植物细胞总计数量不少于500个。如果测定精度难以达到要求，可 次测定中浮游植物细胞的计数总量

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边界及左边界或视野上半圈的细胞不计数，在行格下边界及右边界或视野下半圈的细胞计数， 或细胞残体不计数。 12.2计数过程中，如果发生样品水分蒸发，在计数框中形成气泡，则弃去本片重新取样计

附录A （规范性附录） 随机视野方式检出限的计算

附录A给出了随机视野 式的稳出限与欢祭的视野数、视野值 积和计数框面积有关。当浓缩f倍时，按照公式（A.1）计算方法检出限

MDL: A ×ln0.01×108 ne×V×s×f 式中：MDL 方法检出限，cells/L； A 计数框面积，cm； ne 观察的随机视野数，个； V—计数框容积，L; 显微镜1个视野的面积，μm2/个； F一浓缩倍数； 0.01——显著性水平； 108 面积换算系数，Lm/cm。

B.1显微镜视野面积的测量

B. 1. 2 测量工具

B.1.2.1载物台测微计

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载物台测微计（6.12）是一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。圆圈内刻有分度，将长1mm的 直线等分为100个小格，每个小格长度等于10um。

B.1.2.2目镜分划板

图B.1载物台测微计示意图

目镜分划板（6.13）是一块有刻度的圆形玻璃片，通常刻度是将5mm分划为50格。使用前 勿台测微计进行标定。

图B.2目镜分划板示意图

B.1.3显微镜视野面积测量步骤

B.1.3.1装人目镜分划板（6.13）。旋下目镜上的目透镜，将目镜分划板放人接目镜的申隔板上，使 有刻度的一面朝下，再旋上目透镜，并装入镜筒内。 B.1.3.2装入载物台测微计（6.12）。将载物台测微计置于显微镜的载物台上，有刻度的一面朝上， 并调整具有刻度的小圆圈至视野中央。 3.1.3.3载物台测微计标定目镜分划板。先用低倍镜观察，对准焦距，待看清载物台测微计标尺的刻 度后，转动目镜，使目镜分划板的标尺与载物台测微计的标尺相平行，并使它们的左边第一条刻度线相 重合，再向右寻找两尺的另一条重合刻度线。载物台测微计标定目镜分划板见图B.3。

图B.3载物台测微计标定目镜分划板示意图

记录两条重合刻度线间的目镜分划板标尺的格数Nw和载物台测微计标尺的格数Ns。按照公 单目镜分划板标尺1格所代表的实际长度L。

式中：Le一一目镜分划板标尺1格所代表的实际长度，μum； N一一两条重合刻度线之间载物台测微计标尺的格数，个； Nw一一两条重合刻度线之间目镜分划板标尺的格数，个； 10一载物台测微计标尺上单格的长度，μm。 B.1.3.5测量显微镜视野面积。用标定后的目镜分划板，测量视野的直径d，再用圆面积公 野面积

式中：s——显微镜1个视野的面积，um； 圆周率； d——显微镜视野直径，μm; 直径和半径换算系数2的平方。

压力容器标准B.2显微镜视野面积的计算

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通过显微镜的目镜所观察到的圆形区域称为视野。按照公式（B.3）计算视野直径，再利用圆 代计算视野面积，单位为mm。

式中：d—显微镜视野直径，mm;

B. 2. 2目镜视场数

B. 2.3 物镜的放大率

螺钉标准指物镜的放大倍数。生物显微镜常用的物镜放大率有4X、10×、20×、40×和100×。浮游 文常用的物镜放大率为20×和40×

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