T／CNCIA 03002-2020  涂料（漆膜）抗病毒性能测试方法

5.3.7灭活的胎生血清（FBS）

把低温贮藏的胎牛血清于37℃水浴解冻溶解。然后，将水浴锅的水温升温至56℃后再维持 30min灭活，分装后置于一20℃冰箱里保存。使用前，于37℃水浴解冻

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房屋建筑标准规范范本5.3.10双倍浓度的维持培养基

5.3.11磷酸盐缓冲液（PBS)

将8.0gNaCl、0.2gKC1、2.9gNa2HPO·12H2O和0.2gKH,PO.溶于1000mL的水中制备 PBS，用压力蒸汽灭菌（见6.2）。配制后如不立即使用，应置于2℃～8℃保存。保存期限不得超过 1个月。

5.3.12从生胰腺分离的胰蛋白酶和PBS溶液

5.3.12.1将从牛胰腺分离到的1.0g胰蛋白酶溶解于100mLPBS中，并用震荡器震荡2h以充分混 匀。使用0.22um过滤器对溶液进行过滤除菌。如不立即使用，则分装后放在一80℃冰箱里保存。使 用前，于37℃水浴解冻。 5.3.12.2将1.0mL按5.3.11.1要求配制的溶液加至9.0mLPBS中混匀，分装并保存在低于一20℃ 的冰箱。使用前，于37℃水浴解冻

将2.5g胰蛋白酶、0.1g硫酸卡那霉素、0.1g硫酸链霉素、2mg的两性霉素B和0.014mo1EDTA 溶于1000mLPBS中。使用0.22μm滤器过滤除菌，将溶液分装并保存在低于一20℃的冰箱。使用 前，于37℃水浴解冻。 注：胰蛋白酶EDTA溶液可以使用商品化成品。配方不同的应经验证合格后使用

用于蚀斑试验的琼脂培养

溶液加人1000mL双倍浓度的维持培养 充分混匀。对流感病毒的蚀斑试验时，加3.0mL胰蛋白酶。使用前，把溶液放37℃水浴锅温浴。

将15g细胞培养琼脂溶于1000mL水中混匀，用高压蒸汽灭菌。使用前，将溶液放60℃水

5.3.15.3琼脂培养基的制备

5.3.16卵磷脂吐温大豆酪蛋白培养液（SCDLP肉汤培养基）

将17.0g酪蛋白陈、3.0g天豆蛋白藤、5.0gNaCL、2.5gNa2HPO4、2.5g葡萄糖和1.0g卵磷月 1000mL水中。搅拌均匀后加人7.0g非离子型表面活性剂吐温80，用NaOH溶液或HC1溶溶 I值调整至6.8～7.2(25℃），用高压蒸汽灭菌。配制后如不立即使用，应置于2℃～8℃保藏。 限不得超过1个月

34±1）℃和（37±1)℃，可维持5%的二氧化碳浓

可以满足温度（121土2）℃和压力（103土5）kPa下的操作。

于灭菌或干燥试验材料

能保持160℃～180℃的温度，温度波动不超过士2℃。控速范围500r/min~10000r/min， 确度1%。

符合YY0569要求的IⅡI级及以上生物安全相

合YY0569要求的Ⅱ级及以上生物安全柜

用于培养细胞的观察。

量程:10 μL~100 μL,100 μL~1 000 μL,1 ml

控温范围：25℃~55℃，温度准确度1℃

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空温范围20℃～50℃，温度准确度1℃。

20℃~50℃，温度准确

6.13其他微生物学试验耗材

用于试剂配制和微生物培养的培养皿 试管、锥形瓶等其他微生物学试验耗材

7.1从低温中复苏宿主细胞

不新的有通气帽盖的75cm组 胞瓶，加人20mL生长培养基，将融化的全部细胞转入细胞瓶中。将细胞瓶放进细胞CO2培养箱 37℃土1℃，5%CO，），培养（24土2)h，用显微镜观察细胞是否贴壁长满，若细胞长满后按照宿主细胞 传代培养的步骤开始连续传代.若没长满.继续培养

准备好长满的宿主细胞。将冷冻的病毒放人（37士1）℃水浴，使其迅速解冻，并将其转移倒一个新 的试管中，用维持培养基将其稀释到10"PFU/mL（或TCIDso/mL）～10*PFU/mL（或TCIDsc/mL）。 接种1mL稀释好的病毒液到细胞瓶中的细胞表面，使其覆盖均匀。将细胞瓶放人CO培养箱，培养 h使病毒吸附人细胞。补足适量维持培养基至细胞瓶，并将细胞瓶放人CO2培养箱培养1d～3d,增 病毒，其中流感病毒采用含0.15%牛胰腺提取胰蛋白酶的维持培养基，EV71采用维持培养基，培养 条件见表1。逐观察细胞病变，判断流感病毒的增殖情况。若细胞已发生3/4病变后，将含有病变细 饱及病毒的培养液放人离心管中，于（4士1）℃，1000g离心15min。离心后，取上清，即得到病毒液。按 适当体积将病毒液分装，置一80℃保存。通过蚀斑或TCIDso方法检测病毒滴度是否超过10°PFU/mL（或 TCIDso/mL），若滴度低于10°PFU/mL（或TCIDsa/mL），则从头开始重新制备。使用前，将冷冻的病毒 放人（37士1)℃水浴，使其迅速解冻。解冻后即为检测用的病毒悬液，若不立即使用，可暂存于2℃～ ℃冰箱，不得超12h。 注：实验室可以根据实验技术能力和经验，选择其他文献报道的有效的病毒繁殖方法

7.4.1产品按GB/T3186的规定进行取样，也可以按照商定的方法取样。 7.4.2制备试板时，除非另有规定，一般采用无抗病毒作用的灭菌金属板、玻璃板或塑料片为载体，尺 于为50mm×50mm，厚度为1mm～10mm。按照产品的使用说明稀释或配比后进行涂刷。涂料的 施涂方式及涂布量按照说明书规定要求进行，样板表面应平整，无锈无油污。试板涂刷后烘干或于室温 下干燥，然后在GB/T9278规定条件下至少干燥7d后再用于试验。粉末涂料、辐射固化涂料试板的 制备方法可经双方商定。 7.4.3采用灭菌金属板、玻璃板或塑料片等载体制备空白对照样品，以添加入抗病毒成分的涂料制备 试样。其中空白对照样制备12片，抗病毒试样制备9片。试验前用生物安全柜中的紫外灯照射 30min，消毒后进行测试

取空百对照样及抗病毒试样各3片，放在培养血中，加入10mLSCDLP肉汤或其他经验证有效的 中和剂，使用移液器吹打4次以上，以确保试样经过充分清洗。以洗脱液接作为试验样液，采用蚀斑法 或TCID5o法测试，观察细胞有无损伤。 若未观察到细胞毒性，继续下一步骤。 若观察到有细胞毒性，则需酌情更改、修改培养基配方或增加中和剂的使用量。若因样片的尺寸利 性质，采用10mL中和剂回收洗脱有困难，则可增加中和剂溶液用量。 若中和剂的配方修改、更改或增加，则在后续试验中应使用相同的洗脱液或中和剂

7.6细胞对病毒的敏感性和中和效果验证试验

取空百对照样及抗病毒试样各3片，放在培养血中，加入10mLSCDLP肉汤或其他经验证有效的 中和剂.使用移液器吹打4次以上，以确保试样经过充分清洗。从皿中取5mLSCDLP肉汤回收液到 5支新的试管中。另取3支试管，分别加人5mLSCDLP肉汤培养基做为阴性对照。加50μL制备好 的浓度为4×10°PFU/mL～6×10°PFU/mL（或TCIDso/mL）的病毒悬液至上述9支试管中，25℃放 置30min。作用结束后，采用蚀斑法或TCIDso法测试阴性对照、空白对照样及抗病毒试样的洗脱回收 液中病毒的滴度

7.6.2实验有效性的条件

将阴性对照与空白对照样及抗病毒试样回收得到的病毒滴度作比较，其对数值应满足式（1） 的要求，

Sn一一三个SCDLP肉汤培养基阴性对照回收的平均病毒滴度对数值，单位为PFU/mL(TCIDso/ml S一一一三个未经抗病毒处理的试样回收的平均病毒滴度对数值，单位为PFU/mL（TCIDso/mI S.一一三个经抗病毒处理的试样回收的平均病毒滴度对数值，单位为PFU/mL（TCID50/mL） 若以上结果超过0.5，中和剂的配方应该酌情修改或更改，或增加中和剂的量 若中和剂的配方修改或更改，或增加用量.则在正式试验中应用使用相同的中和剂

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取制备好的空白对照样6片，试样3片，分别放入无菌培养皿中，测试面朝上

按照检测病毒的制备步骤，制备试验用病毒。试验前，将冷冻的病毒置（37士1)℃水浴，使其迅速融 化。用维持培养基将病毒悬液浓度调整在1×10°PFU/mL～5×10PFU/mL用作接种液，若接种液 不立即使用，可暂存于2℃～8℃冰箱，不得超过12h。 用移液管吸取0.4mL接种液，滴到每个试样表面。并将制备好的40mmX40mm薄膜盖于接种 子的病毒悬液上，并向下轻轻压薄膜使病毒悬液向四周扩散，确保病毒悬液不要从薄膜边溢出。在试样 接种完并盖上薄膜后，盖上培养皿盖， 注：接种液不能从覆盖膜边缘溢出。如有接种液溢出时，可适量减少接种液体积，但体积不应小于0.1mL，当接种 液体积减小时，应增加接种液病毒滴度，以保 标准规定的病薛滴度相同

8.3接种后试样的培养

亲特别说明外，含有接种 的培养皿，在（25士1）℃、相对湿度不小于90% 的条件下培养24h.也可以选择其 且不超过24h

8.4.1接种后，立即对已接种的3片未做抗病毒处理试样进行病毒回收。在客培养血中加入10m1 SCDLP肉汤或其他适宜而有效的中和剂，充分吹打（4次以上）以洗脱回收病毒。对回收得到的病毒洗 脱液进行滴度测定。测定方法见8.5， 注1：若中和剂的体积或成分更改，应在试验报告中记录。中和剂的体积更改时应在计算时予以考虑 注2：可以使用其他的回收洗脱方法。回收方法的变更可能会影响所测得的抗病毒活性结果，应充分证实其有效性 才可使用，并在报告中注明。 3.4.2根据8.3的程序培养后，按照8.4.1处理3片空白对照样和3片经抗病毒处理的试样，然后立即 对试样上的病毒滴度进行测定

实验室可以根据自身的实验条件和实验技术，选择蚀斑法或TCIDsc法等试验方法进行病毒滴度

实验步骤：在6孔细胞培养板的每个孔内培养单层细胞，并用显微镜观察细胞的生长状态。当观察 到长满的单层细胞时，弃掉生长培养基。加适量细胞维持培养基洗掉残留的生长培养基，重复洗2次。 先脱液原液及每个梯度的稀释液均接种2孔用于测试，接种量0.1mL。如果原液接种到第一个2孔， 则接下来的2孔接种1/10稀释液，以此类推。最后一个2孔，接种维持培养基，做阴性对照。把6孔板 放人CO2培养箱孵育1h，以便让病毒吸附到细胞上。每隔15min摇一下细胞板，让病毒悬液充分和 胞接触。培养后，取2mL～3mL维持培养基加到6孔板上，清洗表面，然后弃掉多余的培养基。加 人3mL琼脂培养基做蚀斑实验，盖上盖子并放室温10min左右让琼脂培养基凝固。待琼脂培养基凝 固后，倒置细胞板，放入CO2培养箱中培养2d～3d。从培养箱中把细胞板拿出来，放正，添加3mL的

福尔马林溶液以固定细胞，令其在室温下固定至少1h。弃掉的琼脂培养基，添加3mL亚甲基蓝溶液， 室温下保持15min对细胞染色。染色完毕，弃掉亚甲基蓝溶液，用水冲洗一下。确认细胞染色。计算 斑的数量（白色斑点），取两个孔的平均值。 PFU的计算：从接种了不同稀释度病毒液的培养孔计数得到蚀斑的数量（空斑的数量宜在60个以 内，超过60个时，空斑的边界将不清晰）。空斑的数量以每个稀释度上两个数据的平均值计。对合适的 稀释度上的蚀斑进行计数，其空斑数量如下标准进行： a）如果不同稀释度中的一个出现了6～60，则取6～60进行计算； b）如果原液的空斑数<6，则取原液孔上的空斑作为测试的PFU； c）如果原液的空斑数<1,则以1计算测试的PFU

8.5.2TCIDn法

在96孔细胞培养板的每个孔内培养单层细胞，并用显微镜观察细胞的生长状态。当观察到长满的 单层细胞时，弃掉生长培养基。加0.1mL细胞维持培养基洗细胞表面，重复洗2次。洗脱液原液及每 个梯度的稀释液均接种8孔用于测试，接种量0.1mL，并以维持培养基做阴性对照。把96孔板放二氧 化碳培养箱孵育1h，以便让病毒吸附到细胞上。之后弃掉96孔板的上清液，取0.1mL细胞维持培养 基，洗板，弃掉多余的细胞维持培养基。加入0.1mL细胞维持培养基后将96孔板放CO2培养箱培养 3d～7d。通过倒置显微镜观察细胞病变。确认细胞病变之后用Behren和Karber方法计算TCIDso 得到每毫升采样液中的病毒数量（TCID5o/mL） 注：培养时间及温度可以随测试病毒的种类进行改变

8.6.1病毒滴度计算

8.6.1.1蚀斑法病毒滴度计算

对于每个试样，都按照式（3)来计算病毒滴度。 N=(10XC×D×V)/A ：（3） 式中： N——每个试样每平方厘米的病毒滴度； C 一一两个孔的平均蚀斑数； D 稀释倍数： V 一 用于洗脱的SCDLP培养液的体积，单位为毫升（mL）； A 一—覆盖膜的表面积，单位为平方厘米（cm）。 计算每组试样回收病毒滴度的算数平均数.保留2位有效数字

8.6.1.2TCIDsm法病毒滴度计算

对于每个试样，都按照式（4)来计算病毒滴度， N=(10 ×X C×V)/A 式中： N—每个试样每平方厘米的病毒滴度； C —TCIDso值; 用于洗脱的SCDLP培养液的体积，单位为毫升（mL）； 覆盖膜的表面积，单位为平方厘米（cm"）， 计算每组试样回收病毒滴度的算数平均数.保留2位有效数字

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8.6.2试验有效条件

8.6.2.1当以下给定的3个条件均得到满足时，试验才被认定为有效。反之，则试验无效，应重新进行 试验。 8.6.2.2空白对照样接种后即时测得的蚀斑数的对数值应满足式（5）的要求

Lmax 试样上最大病毒滴度的常用对数值（以10为底的对数值）； Lmin 试样上最小病毒滴度的常用对数值； 三个试样平均病毒滴度的常用对数值。 8.6.2.3空白对照样的试样接种后即时测得的平均蚀斑数应在2.5×105PFU/cm（或TCIDso/cm）至 1.2×10°PFU/cm（或TCIDsa/cm）的范围内。 8.6.2.4每个空白对照样接种后培养24h的病毒滴度不应小于2.0×10"PFU/cm（或TCIDsa/cm）。

8.7抗病毒活性的计算

采用1支30W、波长为253.7nm的符合 3的紫外灯，紫外灯距离试板0.8m~1.0m，照 h,经处理的试板抗病毒耐久性性能按 章的规定进行试验

试验报告至少应包括以下信息： a）注明采用本标准； b） 试验起始日期及试验环境等基本信息； c）空白对照样及抗病毒试样的制备过程及底材类型等； d）试验用毒株与宿主细胞的类型和编号水电标准规范范本，如采用其他毒株和宿主细胞需说明原因； e）试验接种液的体积：

接种液的病毒滴度； g）试验接触时间； h）试验中空白对照样及抗病毒试样上回收得到的病毒滴度； 抗病毒活性值或抗病毒率； i）任何与本标准的偏离

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附录A （资料性附录） EMEM培养基配方表 表A.1列出了EMEM的配方。试验中允许使用商品化等效培养基

电力标准规范范本附录A （资料性附录） EMEM培养基配方表

表A.1EMEM配方表

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