新规范

，对每只受试蜂单独称重，然后随机放人不同试取

可在红色光或灯光下进行包括试验处理和观察在内的试验操作。将蔗糖溶于水中制备最终浓度为 500g/L的饲喂溶液（例如500g/L的蔗糖水溶液），使用适当的饲喂器（饲喂器可采用剪掉尖端的市售 容积2mL的塑料注射器），饲喂所有受试蜂。在暴露阶段，受试蜂喂食含有受试物或参比物的饲喂溶 液。在观察期间，所有受试蜂均自由进食未加受试物的500g/L蔗糖水溶液

7.5.1受试蜂应在试验条件下（包括单笼饲养）至少驯养8h，自由饮用未加受试物的500g/L的蔗糖 水溶液。在试验开始前一且发现濒死的大黄蜂，应及时丢弃并用健康的大黄蜂代替。因此，笼具和养 工蜂的数量应超过试验所需受试蜂的数量。宜多准备5%的受试蜂和笼具。应额外考虑对非摄食蜂的 补偿，见8.3.5。 7.5.2为确保受试蜂在4h内摄入含有受试物的饲喂溶液，受试蜂在暴露前禁食2h～4h，

7.6.1将受试物贮备液或受试物与500g/L的蔗糖水溶液混合。对水溶性好的受试物，用水溶解。对 水溶性差的受试物，可用有机溶剂（如丙酮）溶解。根据受试物溶解性选择溶剂的浓度镀锌板标准，并将受试物处理 组和溶剂对照组按相同方式处理。如果用丙酮作溶剂，最终饲喂溶液中丙酮的浓度应尽量低，且最大浓 度不应超过5%（体积分数）。只要符合溶剂对照组的有效性要求，也可使用任何其他溶剂、增溶剂或增 稠剂（例如，改善饲喂溶液的均匀度）。 7.6.2通过稀释贮备液或高浓度溶液来准备最终饲喂溶液，即500g/L的蔗糖水溶液。 7.6.3如果使用溶剂、增溶剂、分散剂等来溶解受试物，应制备适当的溶剂对照组溶液。在这种情况 下，应使用两个独立的对照组：一个是500g/L蔗糖水溶液的空白对照组，另一个是含有溶剂、增溶剂、 分散剂等的溶剂对照组，浓度与受试物处理组相同。

7.7.1试验期间，饲喂溶液添加受试物后，至少取出一份最低浓度和一份最高浓度的受试物溶液，直接 放在一18℃以下冷冻保存，用于分析受试物实际浓度。如果使用贮备溶液制备饲喂溶液，额外取一份 用于准备饲喂溶液的贮备液冷冻保存，用于分析。 7.7.2如果试验期间使用不同批次的受试物，应从每一批次受试物的溶液中分别取出一份最低浓度和 一份最高浓度的受试物溶液，分析每批次受试物实际浓度 宜使用同一批次受试物进行试验。

8.1设置试验组和对照组

结果分析时所选用的统计学方法。 8.1.2每个浓度的受试物处理组至少设30个平行（笼），每个平行（笼)中1只受试蜂。对于毒性较低 受试物，可用50个平行（笼)的空白对照组和受试物处理组、至少30个平行（笼)的毒性参比物对照组 行限度试验

8.1.3个蜂群的受试蜂数量不够进 个（至少三个)蜂群的工蜂。应 将来自不同蜂群的受试蜂随机分在各 个处理组内的任何蜂群效应，

8.2使用溶剂时的对照组

如果试验中使用溶剂，应设置2个对照组：水空白对照组和溶剂对照组。检验水空白对照组和溶剂 对照组的统计学显著性差异。如果没有显著性差异，可将这两个对照组一并进行进一步的统计学评价。 如果存在统计学的差异，溶剂对照组结果用于计算LDso和校正受试物处理组的死亡率。

8.3.1为每只受试蜂提供40μL含有适当剂量受试物的500g/L蔗糖水溶液。如果有足够证据证明合 适，也可用其他体积。为准确测定摄食量，在饲喂前后对灌装了添加受试物的饲喂溶液的饲喂器进行称 重。饲喂开始时，将装有添加受试物饲喂溶液的饲喂器插人试验笼中；饲喂结束时，将这些饲喂器更换 为装有不含受试物的500g/L蔗糖水溶液的饲喂器。暴露时间不应超过4h。然后提供未处理的 500g/L蔗糖水溶液供受试蜂自由饮用。 8.3.2对于某些化学品，在较高剂量下，受试蜂拒食受试物可能导致摄食量很少甚至没有。最长4h 后，应用无受试物的500g/L蔗糖水溶液替代未食用的含受试物的饲喂溶液。 8.3.3试验中可能出现所谓的“非摄食蜂”。这些受试蜂未进食蔗糖溶液，未暴露于受试物。即使在对 照组中，在相同条件下，“非摄食蜂”的摄食量也明显低于其他受试蜂。“非摄食蜂”是在最大暴露（饲喂》 期内，消耗量小于各处理组平均消耗量的80%的特殊受试蜂。由于摄食量有限，“非摄食蜂”尚未充分 暴露于受试物，因此不应在终点计算中考虑。否则，“非摄食蜂”的有限暴露可能导致高估LDso值。如 果剔除不相关的低摄食数据点，应在10.2试验报告中说明。 8.3.4如需要，试验结束后，将受试蜂分为摄食和非摄食两类，在原始数据和最终报告中提供二者全部 数据记录。非摄食蜂的数据应在数据记录中进行标记，并在终点计算时排除这些数据。特殊情况下（例 如，观察到受试物的拒食作用），如果合理，可将摄食阈值较低的个体纳入分析。 8.3.5为了弥补每个受试物处理组中的非摄食蜂缺失的数据点，每组宜使用超过30只受试蜂，并使用 摄食蜂替换非摄食蜂。 注：驯养期间死亡的大黄蜂需要额外补充

试验过程中，受试蜂应放在避光、稳定、可控的人工气候条件下，温度25℃士2℃，相对湿 （60士20)%。试验过程中还应采用合适的且经过校准的设备持续记录这些试验条件。短期（2h以内） 偏离此范围（如由于启动操作）在一定程度上是不可避免的，一般不会对试验造成较大干扰。

受试蜂对受试物暴露后，至少观察48h。 在对照组的死亡率保持在不大于10%的可接受水平时， 若至少一个受试物处理组24h～48h之间死亡率增加大于10%，则应延长试验时间，最长至96h。

8.6.1在试验开始后4h～5h记录死亡率，并在24h、48h分别记录死亡率。如果延长观察时间，应在 72h和96h后进行进一步评估

GB/T416222022

死的：受试 的活动，对外来刺激（如光照或吹风）只有微弱 的反应；这样的受试蜂大多死亡，只有少数能恢复

在试验结束时如果同时满足以下条件，试验结果有效： a）只有500g/L蔗糖水溶液的空白对照组受试蜂的死亡率不大于10%；溶剂对照组（如有）： 蜂的死亡率不大于10%； b）毒性参比物对照组受试蜂的死亡率不小于50%，

试验报告应包括以下内容

受试物和参比物： · 单一组分的物质：物理状态、水溶解性及相关的物理化学性质；化学标识，如IUPAC名称 或CAS名称、CAS号、SMILES码或InChI码、通用名、结构式、纯度、杂质的化学鉴别（如 适用且实际可行）等信息（如有机碳含量，如适用）； · 多组分的物质、UVCBs(成分未知或组分多变、复杂反应产物或生物材料)和混合物：通过 化学鉴别获得尽量多的各组分特性信息、相关理化特性； ·来源、批次和/或批号（如有）； 受试物在水或溶剂中的溶解度（如有）； 一 物理状态和相关理化性质； ·化学鉴别标识，如化学名、IUPAC号或CAS号。 b）试验系统： ? 受试蜂学名、种类、来源、以周为单位的近似蜂龄（如有）、采集方法、采集日期、每只体重及 健康状况；

·采集受试蜂蜂群的所有相关信息，包括健康状况、成体疾病、预处理等（如有）。 试验条件： · 试验设计的描述：处理组（包括对照组和参比物对照组）的数量、每个处理组的平行 受试物的试验剂量； · 实验阶段和养阶段的温度以及相对湿度； · 试验操作和评价期间的光源； 试验笼具描述（包括类型、材料、大小、饲喂装置等）； · 受试物剂量准备：所用溶剂、增溶剂、分散剂等，所用的蔗糖； 试验溶液的体积和受试物处理所用的时间； · 试验的时间和地点。 试验结果： 原始数据：各试验浓度在每个观察时间点的死亡率； 受试物在饲喂溶液中的标称浓度和实测浓度，以及采用的浓度分析方法； 根据每个受试物处理组的平均摄食量计算受试物消耗量，作为每组的实际摄入量； 每个受试物处理组“非摄食蜂”和“摄食蜂”的数量； · 试验结束时的剂量反应曲线图（若适用）； 对照组和参比物对照组受试蜂的死亡率； · 在每一观察时间点的受试物LD5o值（95%置信限）； ? NOED值（如果能得到）； · 得到LDso值和NOED值的统计方法； 观察到的亚致死效应； 对本文件的偏离情况及其他相关信息。

·采集受试蜂蜂群的所有相关信息，包括健康状况、成体疾病、预处理等（如有）。 试验条件： · 试验设计的描述：处理组（包括对照组和参比物对照组）的数量、每个处理组的平行 受试物的试验剂量； · 实验阶段和养阶段的温度以及相对湿度； · 试验操作和评价期间的光源； · 试验笼具描述（包括类型、材料、大小、饲喂装置等）； · 受试物剂量准备：所用溶剂、增溶剂、分散剂等，所用的蔗糖； 试验溶液的体积和受试物处理所用的时间； · 试验的时间和地点。 试验结果： · 原始数据：各试验浓度在每个观察时间点的死亡率； 受试物在饲喂溶液中的标称浓度和实测浓度，以及采用的浓度分析方法； · 根据每个受试物处理组的平均摄食量计算受试物消耗量，作为每组的实际摄入量： 每个受试物处理组“非摄食蜂”和“摄食蜂”的数量； · 试验结束时的剂量反应曲线图（若适用）； 对照组和参比物对照组受试蜂的死亡率； ? 在每一观察时间点的受试物LD5o值（95%置信限）； ? NOED值（如果能得到）； 得到LDso值和NOED值的统计方法； 观察到的亚致死效应； 一 对本文件的偏离情况及其他相关信息。

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附录A （资料性） 试验笼具、时间和受试蜂选择的补充信息

试验期间，每只受试蜂应放置在独立的笼具中。 宜使用带有2mL塑料注射器（剪掉尖端，扩大受试蜂的取食开口）的蜂王育种系统（见图A.1～ 图A.3）。独立的笼具并排放置，允许各受试蜂之间膜觉和视觉交流。

止回阀标准图A.1单个笼具示意图

图A.2单个笼具示意图

注：几个笼具并排安置，允许相邻受试蜂之间视觉和嗅觉的交流！

注：几个笼具并排安置，允许相邻受试蜂之间视觉和嗅觉的交流

建筑标准A.3关于大黄蜂采集和随机分组的补充

图A.3多个笼具设置示意图

[1］GB/T21812一2008化学品蜜蜂急性经口毒性试验 [2JOECD Guidelines for TheTesting of Chemicals No.213Honeybees,acute oral toxicity test (1998) [3JOECDGuidelines for TheTesting of Chemicals No.247Bumblebee,acute oral toxicity test(2017)